Das Gebäude, in dem die Galerie der Uffizien ihren Sitz hat, wurde Mitte des 16. Jh von dem Architekten Giorgio Vasari (1511-1574) erbaut, in einer Zeit also, in der Cosimo I. de Medici, Großherzog der Toskana, auch auf bürokratischer Ebene seine neue Herrschaft konsolidierte. Ursprünglich waren die Räume für die “Uffici” delle magistrature (Büros der Richterämter) bestimmt, daher auch der Name. Doch von Anfang an hielten die Medici, leidenschaftliche Kunstsammler und Mäzene, einige Säle in der obersten Etage des Gebäudes für die besten Stücke ihrer zahlreichen Sammlungen frei, welche zwei Jahrhunderte später, dank der Großzügigkeit von Anna Maria Luisa, der letzen Erbin der Dynastie, zu öffentlichen und unveräußerlichen Gütern wurden.

Das Museum umfaßt derzeit die Säle in der dritten Etage des Gebäudes, in welchen in chronologischer Folge Gemälde aus dem 13. bis 18. Jh ausgestellt sind, mit einem besonderen Schwerpunkt auf den Werken der italienischen Renaissance, welche die kostbarste und bekannteste Gruppe der Uffizien bilden; doch sind auch bedeutende Abschnitte der ausländischen (deutschen, flämischen, niederländischen und französischen) Malerei vertreten.

Neben den Gemälden sind in den drei Museumsfluren, deren Decken mit Fresken von Grotesken aus dem 16. bis 18. Jh bemalt sind, auch eine bedeutende Sammlung von Skulpturen aus der Römerzeit ausgestellt (Porträits, Kaiser, Gottheiten).

Im Erdgeschoß sind die Reste der alten romanischen Kirche San Piero Scheraggio zu sehen, die für den Bau der Uffizien teilweise von Vasari zerstört wurde; in der zweiten Etage befindet sich das Kabinett Disegni e Stampe (Zeichnungen und Drucke), wo eine der bedeutendsten Sammlungen der Welt zu bewundern ist, die ebenfalls von einem Medici begonnen wurde, dem Kardinal Leopoldo, im 17. Jh.

Folgt man in der Etage der Galerie dem vorgegebenen Pfad durch die Museumssäle, so trifft man gleich zu Beginn auf die großen Altartafeln von Cimabue, Giotto, Duccio di Buoninsegna, den ersten großartigen Belegen der abendländischen Malerei, gefolgt von den Werken der großen Siener des 14. Jh, Simone Martini und die Brüder Piero und Ambrogio Lorenzetti sowie von der kraftvollen Schule Giottos. Es folgen dann die Grundwerke der internationalen Kunst der Gotik: l’Adorazione dei Magi (Anbetung der Hl. Drei Könige) von Gentile da Fabriano und jene von Lorenzo Monaco, die den vielleicht repräsentativsten Sälen des Museums vorausgehen, welche der Frührenaissance gewidmet sind: Hier sind die Werke von Masaccio, Paolo Uccello, Domenico Veneziano, Piero della Francesca, Beato Angelico zusammengefaßt, gefolgt von den eleganten Madonnen von Filippo Lippi, den wertvollen Gemälden der Brüder Piero und Antonio del Pollaiolo, und schließlich von den mythologischen Allegorien mit ihren stark religiös geprägten Themen von Sandro Boticelli. Von diesem Künstler besitzt die Galerie eine Sammlung der weltweit bedeutendsten Werke, darunter die Nascita di Venere (Geburt der Venus), La Primavera (Frühling) , die Madonne del Magnificat und della Melagrana (mit dem Granatapfel). Weiter führt der Weg zu Perugino, Signorelli, Piero di Cosimo und Leonardo da Vinci; von letzterem kann man neben der „Battesimo di Cristo“ (Taufe Christi), die in Zusammenarbeit mit dem Meister Verrocchio entstand, auch die große „Adorazione dei Magi“ (Anbetung der hl. drei Könige) sowie das Frühwerk „Annunciazione“ (Verkündung) bewundern. Die darauffolgenden Säle (von Nr. 18 bis Nr. 23.) sind die ältesten des Museums. Insbesondere die „Tribuna“ (Tribüne) verdient ein kurzes Verweilen, damit man die Kostbarkeit des großen Schreins erfassen kann, in dem ursprünglich die wertvollsten Stücke aufbewahrt wurden. Heute enthält er unter anderem eine Reihe von Portraits der Medici von Agnolo Bronzino, sowie die berühmteste alte Skulptur des Museums, die „Venere dei Medici“ (Venus der Medici).

In den nächsten kleinen Sälen, die einst als „Armeria“ (Zeughaus) dienten, setzt sich der Pfad der Renaissance wieder fort, uns zwar sowohl mit italienischen Werken von Bellini, Giorgione, Mantegna und Correggio, als auch mit ausländischen Gemälden von Dürer, Cranach, Memling. Geht man zu den Sälen auf der Westseite der Galerie über, trifft man auf große Meisterwerke des 16. Jh., ausgehend vom „Tondo Doni“ von Michelangelo, über die „Madonna del cardellino“ (Madonna mit Distelfink) von Raffaello, zur „Venere di Urbino“ (Venus von Urbino) und zur Flora von Tiziano. Reichhaltig ist auch der Abschnitt der großen Vertreter des Manierismus, von Pontormo über Rosso, Fiorentino und Bronzino bis hin zu Parmigianino („Madonna dal collo lungo“ - Madonna mit dem langen Halse) und zu den großen venezianischen Meistern Sebastian del Piombo, Veronese, Tintoretto und zu jenen aus der Lombardei wie Savoldo und Moroni.

Bis noch vor kurzer Zeit schloß der Besuch der „Galleria“ mit Werken des 17. Jh. der italienischen (Caravaggio, Carracci) und holländischen Schule (Rembrandt) ab; doch in den vergangenen Jahren wurden in den letzten Abschnitten des Museums umfangreiche Restaurationsarbeiten durchgeführt, die zum Teil mit dem Bombenattentat von 1993 ihren Ausgang nahmen, doch auch im Vorausblick auf die Ausdehnung der Galerie auf die unteren Etagen des Gebäudes, in denen bis vor einigen Jahren das Staatsarchiv untergebracht war. Das Projekt dieser „Neuen Uffizien", mit dessen Umsetzung bereits begonnen wurde, sieht eine großangelegte Umgestaltung des derzeitigen Aussehens der Galerie vor, mit der Verdoppelung der Ausstellungsräume, was nicht nur eine bessere Ausbreitung der heute zu konzentriert angeordneten Werke zuläßt, sondern auch die Ausstellung zusätzlicher Gemälde ermöglicht, die bisher in den Magazinen ruhten, oder sogar ganzer Sammlungen, wie die „Contini Bonacossi“, die aufgrund des Raumproblems bereits an anderen Orten ausgestellt sind.

Die Besichtigung der Galerie könnte theoretisch in einem anderen Abschnitt fortgesetzt werden, nämlich in dem berühmten „Corridoio Vasariano“, einem Korridor, der wie der Name verrät von Vasari im Jahre 1565 erbaut wurde. Dieser verbindet auf der einen Seite die Uffizien mit dem Palazzo Vecchio und führt auf der anderen über Ponte Vecchio zum anderen Arnoufer, wo er im Palazzo Pitti und dem Park Giardino di Boboli endet. Der Korridor wurde in jüngster Zeit nach dem Attentat restauriert und verfügt über mehr als 700 Werke, von denen der Großteil aus der berühmten Sammlung von Selbstportraits besteht (von Andrea del Sarto bis hin zu Marc Chagall).