Die „Palatina" genannte Galerie, hergeleitet aus der Tatsache, daß die sich im „palazzo", dem Palast der Herrscherfamilie befindet, wurde vom Hause Lothringen im Jahre 1828 für Besucher geöffnet, bewahrt allerdings noch immer ihren Charakter einer privaten Gemäldegalerie, obgleich mit betont prunkvollen Kunstwerken, deren Kostbarkeit noch gesteigert wird durch die aufwendigen Raumdekorationen und die Pracht der glanzvollen Originalrahmen. Die Ausstellung folgt im Gegensatz zu der Mehrheit anderer in der modernen Zeit eingerichteten Museen weder einer chronologischen, noch einer Ordnung nach Schulen, sondern verweist direkt auf den Reichtum und den persönlichen Geschmack der großen Kunstsammler, die den Palast bewohnten. Die Säle dieser Galerie, zu denen man über die von Ammannati gebaute Prunktreppe gelangt, dienten zur Zeit der Medici als Wohnsitz des Großherzogs bzw. als seine Audienzsäle; sie sind zum Teil mit Fresken von Pietro da Cortona (1596-1669) ausgemalt, mit einem eindrucksvollen und dekorativen Zyklus, der mittels Beispielen, die der klassischen Mythologie entnommen sind, auf Vita e all'educazione del Principe (das Leben und die Erziehung des Fürsten) anspielt. Diese Gruppe von Fresken und Stuckarbeiten, die zu den Höhepunkten des Barocks in Florenz zählt, stellt eine würdige Krönung der hier ausgestellten bedeutenden Werke des 16. und 17. Jh dar.

Eine der bedeutendsten Gruppen der Sammlung sind die Werke von Tiziano und Raffaello, die zu den Medici über das Erbe von Vittoria della Rovere, dem letzten Sproß der Herzöge von Urbino und Gemahlin von Ferdinando II de'Medici gelangten; von Tiziano seien das Ritratto di gentiluomo (Portrait eines Edelmannes) und Maddalena (Magdalena) erwähnt, während von Raffaello hauptsächlich die Madonna del Granduca (Madonna des Großherzogs), die Madonna della Seggiola (Madonna und der Stuhl) sowie das Portrait von Maddalena Doni zu nennen sind.

In der Galerie kann man sich überdies anhand weltberühmter Werke einen breiten Überblick der europäischen Malerei des 17. Jh verschaffen: man denke nur an die Gemälde von Rubens wie I quattro filosofi (die vier Philosophen) oder L'allegoria della guerra (Allegorie des Krieges), an das Portrait des Cardinal Bentivoglio von Van Dyck, an die Portraits von Giusto Sustermans, welche die Gesichtszüge der großherzoglichen Familienmitglieder dokumentieren, die Madonna col Bambino (Madonna mit dem Kinde) von Murillo, l'Amore dormiente (die schlafende Liebe) von Caravaggio, sowie die von Franz Pourbus oder Velazquez gemalten Portraits. Allerdings sind auch Werke aus früherer Zeit vertreten, die durchweg von außergewöhnlicher Bedeutung sind, wie etwa jene von Bronzino, Fra' Bartolomeo, Piero del Pollaiolo und Filippo Lippi.

Einige Säle des Museum haben allein schön für sich genommen einen hohen kunstgeschichtlichen Wert; hier sei auf den in neoklassizistischen Stil eingerichteten Musiksaal hingewiesen, ferner auf den Saal der Putten, der vollständig der flämischen Malerei gewidmet ist, und insbesondere auf die Sala della Stufa (Ofensaal), ein Meisterwerk von Pietro da Cortona, der ihn 1637 mit dem Fresko der Quattro età dell'uomo (vier Lebensalter der Menschen) ausschmückte und damit in Florenz im Auftrag der Medici den Auftakt zur großen Zeit des Barocks gab, welcher der florentinischen Schule der Malerei neue Impulse verlieh.